sd序列的特征

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名词解释：

基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。

基因组（gencme）：细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和（包括一种生物所需的全套基因及间隔序列）称为基因组。基因组的功能是贮存和表达遗传信息。

SD序列(Shine-Dalgarno sequence,SD sequence) 是mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译所需要的序列。SD序列与16S rRNA的3’末端碱基(AUUCCUCCAC-UAG-5’)互补，以控制转译的起始

分子克隆：克隆（clone）：是指单细胞纯系无性繁殖，现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去，在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。

动物克隆(Animal cloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法.

基因诊断：就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构

（DNA水平）及其表达水平（RNA水平）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。

基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的目的基因导入靶细胞后有的可与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。

转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内，使之发育成具有表达目的基因的胚胎动物，并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。

探针：在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标

记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。

限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列并切割dsDNA。

载体：要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。

限制性片段长度多肽性分析(RFLP):DN..段长度多态性分析（restriction fragment length polymer-phism,RFLP）基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在。

简答题：

1.蛋白质的生物合成过程中的成分参与，参与因子，作用？

mRNA是合成蛋白质的“蓝图（或模板）” tRNA是原料氨基酸的“搬运工”

rRNA与多种蛋白质结合成核糖体作为合成多肽链的装配机（操作台）

tRNA

mRNA是合成蛋白质的蓝图，核糖体是合成蛋白质的工厂，但是，合成蛋白质的原料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，需要转运RNA把氨基酸搬运到核糖体中的mRNA上

rRNA

核糖体RNA（rRNA）和蛋白质共同组成的复合体就是核糖体，核糖体是蛋白质合成的场所。

核糖体的大小亚基在行使翻译功能即肽链合成时聚合成整体，为蛋白质的合成提供场所。

mRNA

携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。 从脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸（RNA）。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。

核糖体：

容纳mRNA，并能沿着mRNA由5’——3’ 移动，由tRNA解读其密码；氨基酰位点（A位点），可结合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；肽酰基位点（P位点），可结合肽酰基-tRNA（肽-tRNA）；

肽酰基转移酶中心，是形成肽键的位点等。

起始因子（IF）:翻译起始所需要的催化性蛋白质。促使核糖体和mRNA正确结合

延伸因子（EF）:蛋白质合成过程，帮助进入的氨基酸残基与肽链之间形成酰基，使肽链得以延长的一类蛋白质因子。

释放因子（RF）：识别终止密码子引起完整的肽链和核糖体从mRNA上释放的蛋白质

翻译起始时，第一个氨基酸一般是蛋氨酸，其氨基要甲酰化，予以保护。氨基酰tRNA进入A位肽键的形成蛋白质合成的终止肽链的延伸

2.核酸技术

（1）PCR技术的基本原理：

PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（25∼30次）过程，使目的DNA呈指数扩增。

DNA模板的热变性：将待扩增DNA加热到94℃左右，使双链DNA解开成为单链，并

游离于反应体系中作为模板。

模板与引物的结合（退火或复性）：将体系温度降至合适温度（52℃左右），使加

入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。

引物延伸：将体系温度升到72℃左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在

DNA引物3ˊ端，使链延伸，形成两条与模板互补的新链。

参数

变性温度与时间：一般选择： 94℃，30秒

退火温度与时间：取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选择为Tm - 5℃

延伸温度与时间：一般选择： 70℃ ∼75℃

循环次数：取决于模板浓度， 一般循环：30次

[引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15∼30个碱基。

RNA作为模板时，需要：RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR]

（2）Southem印迹杂交法(Southern blot hybridization)

又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

提取DNA→限制性内切酶酶切→琼脂糖凝胶电泳→DNA用碱变性→变性的DNA转移

到硝酸纤维素膜→加入DNA探针→显影或显色检测杂交信号→证实DNA靶分子是

否含有目的基因片段。

Northem印迹杂交法(Northern blot hybridization)

又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。

（1）检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；

（2）mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）

Northern杂交用于鉴定RNA。其基本原理与Southern杂交相同，只不过变件方法不能采用碱变性法，因为碱导致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚矾、甲醛、甲基氢氧化汞等变性方法。

[分子印迹技术-特点

1.预定性，即它可以根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足各种不同的需要。 　　

2.识别性，即MIPS是按照模板分子定做的，可专一地识别印迹分子。 　　

3.实用性，即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟，但由于它是由化学合成的方法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命.]

（3）DNA测序（双脱氧法原理）

原理利用了DNA聚合酶所具有的两种催化反应特性：第一，DNA聚合酶能以单链DNA

为模板，准确合成出DNA的互补链；第二，DNA聚合酶能以2′,3′-双脱氧核苷三磷酸

为底物，使之参入到寡核苷酸链的3′-末端，从而终止DNA链的延长。[在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了]

3.基因表达的特点（时空特异性）

基因表达(gene expression)是指基因的遗传信息经过转录、转译等极其复杂的生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质的过程，即DNA→RNA→蛋白质。

基因表达是受调控的

时间特异性

按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间特异性(temporal specificity)。多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性(stage specificity)。

空间特异性

基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性(spatial specificity)。

4.分子克隆：

(1) 典型的基因重组（切，接，转，增，检）

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA 。

① DNA的体外重组（切、接）② 重组DNA分子的转化和筛选（转、增）③ 转化子的筛选和鉴定（检）

载体和目的基因的分离；载体和目的基因的切割；载体和目的基因的重组；重组DNA的转化和扩增；重组DNA的筛选和鉴定。

"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲重组的目的DNA（① 直接分离目的基因；② 通过化学合成法和PCR（聚合酶链式反应）扩增法（又称酶促合成法）获得基因；③ 通过构建cDNA文库或基因组文库，从中筛选目的基因）；"切"是指用序列特异的限制性核酸内切酶切割载体和目的基因；"接"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法（原生质转化法、化学转化法、电穿孔转化法）将重组的DNA分子送入宿主细胞中，使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象，“增”进行复制和扩增；"检"则是从宿主群体中通过方法（抗生素抗性筛选、β-半乳糖苷酶插入失活型筛选、营养缺陷型筛选、原位杂交法筛选、Southern印迹法筛选、限制性酶切法筛选、蛋白质生物学功能法筛选、免疫沉淀法筛选、聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选）挑选出携带有重组DNA分子的个体。

(2)DNA分子体外连接技术

黏性末端DN..段的连接

DNA连接酶能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。应用

DNA连接酶可在体外将具有黏性末端的DNA限制片段，插入到适当的载体分子上，从而可能按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子

平头末端DN..段的连接

T4DNA连接酶法：可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。

同聚物加尾法：应用末端脱氧核苷酸转移酶，能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3’ -OH基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴。需用5’特异的核酸外切酶处理平末端的DNA分子上产生带5’ -OH的单链延伸。

化学合成的衔接物连接DNA分子：衔接物(1inker)，是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。

(3)蓝白斑筛选原理

β-半乳糖苷酶插入失活型筛选

载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和筛选，当有外源基因插入该显色基因后，其显色反应消失。【蓝白筛选原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DN..段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DN..段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。】

（4）工具酶是什么？常用的工具酶有哪些？

工具酶（tool enzymes） ：指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。

工具酶的种类:

①u0001 限制性核酸内切酶（restriction endonadease)【Ⅰ、Ⅲ型它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DN..段，与基因工程意义不大。Ⅱ型也就是基因工程说到的限制酶核酸内切酶，Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2+作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DN..段。同裂酶:指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。同尾酶:指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶】、② DNA连接酶（DNA ligase)【催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′-OH、5′-P连接作用。】、③逆转录酶(reverse transcriptase)[逆转录酶是一种多功能酶，它的酶活性有：逆转录酶：以mRNA为模板合成cDNA；DNA依赖DNApol：以ssDNA为模板，3-OH DN..段为引物，合成DNA链。RnaseH ：外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA杂交分子RNA链，有两种：①5′→3′外切RNA，称5′→3′外切RNA酶；② 3′→5′外切RNA，称3′→5′外切RNA酶，也称RnaseH。]、④DNA聚合酶(DNA polymerase)[① 5 ’ →3 ’聚合活性；② 3 ’ →5 ’外切酶活性；③ 在无dNTP时，可以从任何3 ’ -OH端外切；④ 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷暴露时为止；⑤ 在有4种dNTP均存在时，聚合酶活性占主导地位。]、⑤核酸酶(nuclease)[① 降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的单或寡核苷酸，对DNA活性强于u0026gt;RNA;② 中量S1可从切口或小缺口处降解dsDNA;③ 极大量的S1才能降解dsDNA或DNA-RNA杂交链，原因是后者对S1降解有抗性，所以S1又称单链特异的核酸酶。]、⑥末端转移酶[① 催化一个单核酸（dNTP）加到另一个DNA分子的3’－OH末端；② 平端或带延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，](terminal transferase)、⑦碱性磷酸酶[① 去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸根；② 去除5’p ，防止DN..段或载体自身环化。③ 32p标记5’p末端前，先用其去除DNA或RNA上的5’p](BAP或CIP)。

（5）在分子克隆中要作为载体需要哪些条件？

要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生

物细胞（受体细胞），需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载

工具就叫做载体（vector）

载体所具备的特征① 能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子；② 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）；③ 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子④ 载体上要有报告基因或选择标记基因⑤ 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点⑥ 具有较高的外源DNA装载能力。

5.限制性核酸内切酶3’5’端的标记，再用DNA聚合酶聚合，末端有何变化？再用DNA连接酶连接，再酶切，是否能形成相同的末端？

Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。它能识别dsDNA的4~6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4~6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。识别顺序呈二重对称，即180°旋转对称。

形成平头末端（bluntend）PvuⅡⅠ等形成的平头末端

粘性末端（sticky end）：限制酶切割产生2个突出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。

6.应用（判断动物功能，DNA分子体外重组，体外表达的过程）

本文到此结束，希望对大家有所帮助。